三代测序的时机于哪里？

自从本世纪初人类基因组规划完成以后，陪同着基因检测技能的飞速成长。

作者： 年夜康健派编纂来历： 本站原创2017-03-29 15:09:36

自从本世纪初人类基因组规划完成以后，陪同着基因检测技能的飞速成长，于23andMe、ancestry以及华年夜基因等公司，和安吉丽娜。朱莉等明星的不停教诲之下，许多人最先知道，为何有些人饮酒酡颜，为何有些人更易患乳腺癌。这些都与体内某些特定基因特定位点发生变异有关。此刻依托在第二代高通量测序平台，咱们已经经最先测验考试从基因的层面治理咱们的生老病逝世。

这一切都于二代测序的加持下，热火朝天的举行着。可总有一些「小不测」于不停的提示咱们：这还不敷。

二代测序的软肋

几个月前（2016年12月2日），登载于生物学预印消息网BioRxiv上的一篇文章，于基因测序圈激起了不小的风波。一位求医十余年，哄骗Illumina二代测序平台也没有找到病因的患者，被斯坦福年夜学Euan Ashley玻士哄骗Pacific Biosciences（后文简称PacBio）的三代测序平台Sequel乐成确诊为Carney综合征（1）。这是全世界初次哄骗三代测序平台，经由过程全基因组测序于患者体内找到致病突变。标记着三代测序成长到了进入临床运用的拐点。

「二代测序对于在SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）以及小在50bp的InDel（Insertion-Deletion，插入或者缺掉）变异检测相对于比力正确，可是年夜的布局变异检测却很是坚苦。」海内首家三代测序办事公司武汉将来组生物科技有限公司首创人兼CEO汪德鹏告诉奇点网，「PacBio三代测序平台的读长是二代测序的100倍摆布，可以很是好的解决基因布局变异问题。」

▲现存的所有测序技能都不具有通不雅人类基因组的威力。如上图所示，左图是衣服的尺度品，右图一位成衣学徒用划一布料建造的衣服。从总体上看，咱们很轻易发明学徒做的衣服于布局上与尺度品有较年夜差异。然而，二代测序是个一次只能看长 宽为10cm 1cm的教员傅，因而他把学徒的衣服剪成10cm 1cm的布条，末了他可能发明，从学徒衣服上剪下来的布料，可以无缺的拼装到尺度衣服上。而三代测序则是一个一次能看长 宽为10cm 100cm的教员傅，当他接纳一样的要领裁剪衣服于尺度品上比对于时，很轻易就发明，学徒于右侧衣服的设计上颇有新意。由此不雅之，三代测序显然于检测布局变异上更具上风。

自从2005年二代测序技能实现贸易化最先到此刻，因为测序成本不停降落，研究职员已经经于人体内发明了年夜量与疾病有关的基因突变，让咱们对于基因变异与人类康健以及疾病之间的瓜葛有了更深切的理解。然而，近似上面哄骗二代测序技能也不克不及给患者确诊的案例时有发生，这类征象不只呈现于遗传病的诊断上，还可能呈现于寻觅癌症发生的缘故原由（2； 3），肿瘤耐药性孕育发生的缘故原由（4），和精力破裂症（5； 6）等发生缘故原由的探访上。

虽然早于上个世纪50年月中期就已经经有研究职员哄骗核型阐发（Karyotype analysis）不雅察染色体变异，可是颠末近半个世纪的成长，人类对于DNA的布局变异仍然知之甚少。

▲1950年以来DNA布局变异研究的要领，和合用的检测规模，50bp-100kb这个规模的布局变异缺乏很好的检测手腕。

贝勒医学院的份子遗传学家Jim Lupski告诉《天然》杂志的记者Monya Baker的一段妙闻即是明证。早于1991年Lupski团队发明腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth，CMT），是因为某个特定的基因多了一个拷贝（布局变异的一种）致使的时辰（7），学界一片哗然，那些打小就接管经典孟德尔遗传学教诲的专家们不管怎样都不承认Lupski这一发明。学界的不认同，间接致使顶级期刊《天然》以及《科学》拒绝登载Lupski的研究论文，末了他不能不用四种自力的试验要领证实他是对于的，这才被《细胞》吸收（8）。

直到2004年Michael Wigler玻士团队以及Charles Lee玻士团队，别离于《科学》（9）以及《天然遗传学》（10）揭晓布局变异的开创性研究论文。自此，关在布局变异的研究论文最先变多，基因组变异数据库中布局变异的条款数目也逐渐增多（8）。

「非单核苷酸变异占到了人类基因组所有变异的74%，」Craig Venter研究团队于2007年发明（11）。研究职员逐渐意想到，人类遗传多样性的故事用二代测序是讲不完的，由于布局变异也是疾病的主要驱动力。

「长读长对于解决布局变异会有帮忙，」玻德研究所的Steve McCarroll玻士说，他于DNA布局变异对于在精力疾病之间瓜葛的范畴很有建树（6）。

更切合精准医学任务的三代测序

今朝市道上已经经实现贸易化的长读长测序平台重要有Illumina的Tru-seq Synthetic Long-Read、Oxford Nanopore Technologies的纳米孔平台MinION，和PacBio的单份子及时（SMRT）测序平台，此中成长的最为成熟不变的是PacBio的单份子及时（SMRT）测序平台（12）。

于SMR�ֲ�APPT测序平台的降生的65年前，康奈尔年夜学诺贝尔物理学奖患上主Hans Albrecht Bethe（1906-2006）发明了一个征象：当微孔的直径小在光的波永劫，光于穿过微孔韶光强会急剧衰减（13）。没成想，几十年后同于康奈尔年夜学的Watt Webb传授以及PacBio的首创人Jonas Korlach以及Stephen Turner将这一发明酿成了一项技能，零模波导（zero-mode waveguide，ZMW）技能（14）。颠末几年的探索，Webb传授团队发明，ZMW技能可以用来检测并不雅察溶液中的单份子。2003年《科学》杂志以封面的情势报导了这一研究结果（15）。

一年以后，Korlach以及Turner组建PacBio公司。其时人类基因组规划竣事时间其实不久，人们从基因组规划中看到了生命科学的将来，可是一代测序超低的通量以及超高的成本，让研究职员难之前行。寻觅通量高、速率快、价格低的测序要领，成为许多研究职员的胡想。当此之时，罗氏、Illumina以及ABI的二代测序技能还于紧锣密鼓的研发傍边。PacBio也想于测序市场据有一席之地。颠末6年的开发，PacBio基在ZMW技能的SMRT测序平台终究于2009年头降生了，科学杂志再一次登载了这一主要发现（16）。

▲2009年二代测序完成一小我私家的基因组需要10万美元摆布

「于09年的时辰，有一阵子PacBio的测序炒的很厉害，阿谁时辰各人以为，之后会是15分钟测完一小我私家的基因组，成本1000美元，并且读长很长。其时的界说，之以是叫三代，是由于有几个特性，读长长，测序速率快，测序价格要自制。」汪德鹏说。

陪同着研究职员对于SMRT测序平台的殷殷但愿，PacBio于2010年10月上市了，股价靠近17美元，累计召募2亿美元。半年以后，PacBio终究推出全世界首套三代单份子及时测序体系PacBio RS，标记着三代测序进入新时代。其时，以Illumina为首的二代测序平台小我私家全基因组的测序价格方才跌破一万美元年夜关。

随后，一些研究机构最先使用PacBio RS，北京的药用动物研究所也于RS发布半年以后，采办了亚洲第一台RS测序仪。然而，世界各地的研究职员很快发明，RS底子就没有PacBio承诺的那末夸姣，价格昂贵不说，过错率还高，读长也并无比一代测序很多多少少。显然，PacBio过分承诺了。于2012年末，PacBio的股价跌至靠近1美元。

只管云云，照旧有人从中看到了时机。「至今，另有许多人对于SMRT测序平台的熟悉只逗留于2009年：PacBio的测序平台过错率约15%，过高了，不克不及用。」汪德鹏说。

汪德鹏于2011年组建了中国第一家提供三代测序办事的公司武汉将来组，四年以后汪德鹏以及哥伦比亚年夜学生物信息学副传授王凯配合组建了北京但愿组，但愿组是全世界首家将三代单份子及时测序技能运用在疾病检测的企业。去年年末，北京但愿组完成由经纬中国以及赛富投资领投的近亿元人平易近币A轮融资，将全力鞭策三代测序技能运用以及普及。「时机就是当年夜部门人感觉不靠谱的时辰，你却发明了它实在是靠谱的，」汪德鹏说。

三代测序的时机于哪里？

颠末两年的革新进级，PacBio于2013年头推出了RS II，测序数据通量翻一番，其他方面的机能也有必然的革新。就于这时候，于二代测序市场掉利的Roche，意欲借助PacBio杀入人体基因检测体外诊断范畴（IVD），与PacBio签署了高达7500万美元的战略互助和谈，按照和谈PacBio需要开发基因检测临床产物，Roche将得到产物的全世界独家发卖权。于制药巨头Roche的加持下，PacBio股价飞涨73%.

▲SMRT技能测序道理

到2015年末PacBio与Roche配合推出Sequel测序平台，新的平台通量较上一代产物晋升了7倍，别的呆板成本也于年夜幅降落。罗氏测序部分的卖力人Dan Zabrowski暗示，这款测序平台将作为罗氏测序仪器的根蒂根基，最初用在临床研究，以后才用在体外诊断。然而，Sequel推出一年以后，Roche发明Sequel其实不能满意他们进军体外诊断市场的野心，因而与PacBio终止了互助和谈。受此影响，PacBio股价下跌跨越43%.

「罗氏感觉PacBio成长太慢那是由于罗氏需要一个很是年夜的体量的如许一个市场。坦率的讲，三代测序简直没有到达罗氏但愿看到的阿谁水平，无庸置疑，此刻的支流照旧二代测序。可是三代测序对于在咱们如许一个公司而言，这个别量长短常合适的。」汪德鹏说，「另外一个缘故原由是，罗氏其时是筹算哄骗PacBio做HLA以及HPV、HCV、HIV病毒等范畴的诊断，这个今朝还不切合PacBio重要进攻的标的目的。」

▲汪德鹏

然而，西边不亮东边亮，就于Roche与PacBio分手以后，北京但愿组公布采购6台Sequel测序仪，诺禾致源公布采办10台Sequel测序仪。「PacBio的测序平台于基因组范畴的运用日益成熟，咱们到场国际集会时发明，此刻已经经有许多科学家于使用PacBio的测序平台，」诺禾致源副总裁吴俊告诉奇点网，「于采办Sequel以前，诺禾致源现实上也提供三代测序办事，可是咱们的技能评估发明这个平台还不敷不变，以是没有采办。去年年末，进级后的Sequel平台越发不变，数据量以及读长也有显著的晋升。咱们估算了一下三代测序科研市场的2017年的增量，觉得本年采购的10台仪器颇有但愿满负荷运转。」

无庸置疑的是，三代测序此刻的重要运用场景是照旧科研，要走向临床还需要许多科学研究以及技能堆集，而这个范畴海内外的研究机谈判企业正于连续不停的鞭策。吴俊说，「以及二代测序同样，三代测序于医学上的运用也需要一个技能研发以及普及的历程。任何一项技能从科研办事转向临床运用都需要必然的时间。诺禾致源今朝已经经盘踞了科技办事一半的市场份额，咱们但愿新采购的Sequel平台于近一年内对于科研有所鞭策。」

2016年，武汉将来组介入完成的第一个亚洲人参考基因组「中原一号」于线揭晓在《天然通信》上（17）。汪德鹏先容，「中原一号」是用三代测序于做，是黄种人的一个参考序列，并且长短常精准的参考序列，它填补了之前国际参考序列内里存于的200多个洞，此外，他们还找到了 2万多个布局变异。更主要的是，他们发明有一些未知基因序列有转录以及表达，可是由于GC含量的瓜葛于Illumina测序中彻底看不到，这些全新的基因因此前所不知道的。这再次注解，人类基因组另有太多的信息被咱们漏掉失。这些信息与疾病有甚么瓜葛，咱们还全无所闻。

「与二代测序相似，三代测序于临床医学的运用需要一个持久的历程，咱们以为将来2-3年内三代测序会呈现临床运用的成熟产物。别的，我感觉Sequel的呈现对于Pacbio意思庞大，」经纬中国医疗组的孙凌皓说，「长读长的成本降低是年夜的趋向，我不感觉三代测序以及二代测序是互相代替的瓜葛，测序技能成长到此刻，一代测序仍旧有很好的运用场景。但一代测序以及二代测序的局限也给三代测序留下了伟大的市场空间。」

北京但愿组已经经于跟一些详细运用范畴的大夫一路做三代测序的运用开发。例如，于HLA骨髓配型这个范畴，他们于跟中国最年夜的白血病医治病院道培病院集团互助，哄骗三代测序开展HLA分型。此外，作为世界首家三代测序遗传病检测公司，但愿组还于跟中日敌对病院的顾卫红医生一路于SCA（脊髓小脑共济掉调）范畴举行科研互助。

前面Ashley团队的研究结果注解，长读长测序于诊断遗传病上确凿具有二代测序无可相比的潜力。已往几年的研究注解，二代测序做遗传病有很年夜的局限，检出率于30%-50%摆布。「咱们但愿哄骗三代测序来转变这个状态，假如咱们可以或许把检出率提高20%-30%，那意思就很是年夜了。固然，这也是咱们的胡想，尚未酿成实际。」汪德鹏说。

▲Euan Ashley

今朝看来，制约三代测序技能年夜规模运用的重要要素照旧成本。「三代测序此刻做医学检测价格还比力高，没有那末轻易。」吴俊说。据悉，今朝三代测序的成本是二代测序数十倍。然而，这对于在动辄需要3-5年时间才气诊断的稀有病而言，哪种要领带来的利益多，好像是显而易见的。

不外，按照事物的基本成长纪律，三代测序的价格降落是一定的。「假如成本够低的话，各人照旧倾向在可以获守信息更多的要领，」吴俊说。于接管Mendelspod采访时，Ashley更有惊人的舆论，「假如三代测序的成本降到二代的两倍，二代测序的逝世期就到了。」

只管此刻年夜部门人都以为三代测序不会代替二代测序，可是我照旧以为，可以或许提供更多基因组信息的三代测序，以至四代测序必定是将来。到时，人人城市有一个信息无比饱满的小我私家基因组数据库。

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2周前